Régulation de l’expression du gène Nr5a1 au cours de la différenciation du lignage gonadotrope hypophysaire.

Résumé

La différenciation du lignage gonadotrope est un processus qui a lieu durant le développement embryonnaire de l’hypophyse. La spécification du lignage gonadotrope est caractérisée par l’apparition du facteur de transcription NR5A1, également appelé SF-1, marqueur le plus précoce du lignage gonadotrope. NR5A1 est crucial pour l’émergence du lignage gonadotrope puisqu’il permet d’initier l’expression des gènes codant le récepteur de la GnRH et les sous-unités des hormones gonadotropes, LH et FSH. Des défauts d’expression de Nr5a1 entraînent, de ce fait, des anomalies de la différenciation du lignage gonadotrope conduisant à un hypogonadisme hypogonadotrope et une stérilité des individus. Malgré l’importance de ce gène, les mécanismes épigénétiques régulant l’émergence de Nr5a1 lors de la différenciation du lignage gonadotrope restaient mal connus. Les identifier a été l’objet principal de mes travaux de thèse. Dans un premier temps, j’ai participé à l’identification de l’ensemble des régions régulatrices potentielles au sein du locus de Nr5a1 par la technique d’ATAC-seq en utilisant un modèle in vitro de différenciation des cellules gonadotropes murines. Cette étude a permis de révéler l’existence d’une séquence cis-régulatrice intronique de type enhancer, jusqu’alors inconnue. J’ai démontré par stratégie CRISPR-Cas9 que cet enhancer est strictement nécessaire à l’initiation de l’expression de Nr5a1 et que son activation dépend de la fixation du récepteur nucléaire des œstrogènes ERa. Le recrutement d’ERa sur l’enhancer est, en effet, essentiel pour entraîner le remodelage de la chromatine, aussi bien au niveau de l’enhancer a que du promoteur de Nr5a1, ce qui permet in fine d’activer la transcription du gène. Cette étude a donc permis d’identifier l’élément régulateur le plus précocement impliqué dans la spécification du lignage gonadotrope et souligne, de plus, l’importance d’ERa dans la régulation épigénétique de ce processus de différenciation (Pacini V et al. 2019). Cependant, comme ERa ne peut pas se fixer sur l’ADN lorsque la chromatine n’est pas permissive, les mécanismes permettant son recrutement sur l’enhancer restent à être identifiés. Il a été décrit, dans des tissus non hypophysaires, qu’ERa est recruté à la chromatine par l’intermédiaire de facteurs de transcription particuliers : les facteurs pionniers. Ceux-ci sont capables de se fixer sur une chromatine réprimée et de la remodeler localement, permettant ainsi la fixation d’ERa sur ses séquences cibles. Le recrutement ultérieur de co-activateurs par ERa permet ensuite d’initier l’activation de ces séquences. Afin d’identifier à la fois les co-activateurs d’ERa et les facteurs pionniers dans les cellules gonadotropes immatures, j’ai caractérisé, par immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage haut-débit, l’ensemble des séquences cibles d’ERa (cistrome) dans les cellules gonadotropes. Par une analyse bio-informatique, j’ai identifié, à proximité, des sites de fixation pour de potentiels facteurs pionniers. J’ai entrepris, en parallèle, l’identification de l’interactome protéique d’ERa en mettant en place au laboratoire une technique d’identification par biotinylation proximale (BioID) couplée à la stratégie de quantification protéique en SILAC. Cette étude, encore en cours au laboratoire, a permis d’identifier des partenaires candidats susceptibles d’être des facteurs pionniers ou des co-activateurs essentiels au recrutement d’éradication sur la chromatine ou à son activation, et donc importants dans les processus de différenciation du lignage gonadotrope. Les résultats obtenus pendant mes travaux de doctorat permettront de mieux comprendre les mécanismes épigénétiques à l’origine de l’expression du gène Nr5a1 dans le lignage gonadotrope et, in fine, de la différenciation de ce lignage. Les acteurs identifiés dans ces processus seront autant de nouvelles pistes pour mieux caractériser les hypogonadismes hypogonadotropes, souvent idiopathiques.

Abstract

Gonadotrope differentiation is a stepwise process taking place during pituitary development. The early step of this process is characterized by the expression of the NR5A1 transcription factor, also called SF-1. NR5A1 is a crucial factor for gonadotrope cell fate determination since it initiates the transcription of key gonadotrope genes such as the GnRH receptor and LH and FSH specific subunits. Alterations in Nr5a1 expression lead to hypogonadotropic hypogonadism and infertily. Despite the importance of NR5A1, the epigenetic mechanisms regulating its expression during early gonadotrope lineage specification are still poorly understood. We assessed genome-wide chromatin accessibility using ATAC-seq technique in three cell lines recapitulating gradual stages of gonadotrope differentiation and in vivo in developing pituitarie. We highlighted the transient recruitment of a yet undescribed enhancer during gonadotrope specification. Using CRISPR-Cas9 technology, we showed that this enhancer is mandatory for the emergence of Nr5a1 expression during gonadotrope specification. Furthermore, we demonstrated that the binding of estrogen receptor a (ERa) on this enhancer is essential for chromatin remodeling of Nr5a1 enhancer and promoter, leading to RNA polymerase recruitment and transcription of the gene. This study has thus identified the earliest regulatory sequence involved in gonadotrope lineage specification. Moreover, it highlights the key epigenetic role played by ERa in this differentiation process (Pacini V, et al. 2019). However, since ERa cannot bind chromatin when in closed conformation, the molecular mechanisms allowing ERa to activate Nr5a1 enhancer in gonadotrope cells remain to be determined. It has been described in several cellular models that ERa binding to DNA depends on a class of transcription factors called pioneer factors. Pioneer factors have the ability to bind closed chromatin and induce a local changes in chromatin accessibility, leading to the recruitment of ERa on its binding sites. The subsequent recruitment of ERa co-activators will then allow the activation of ERa-dependent transcriptional programs. The second objective of my thesis was thus to identify ERa pioneer factors and co-activators in differentiating gonadotrope cells. Using ChIP-seq assay, we identified all the ERa binding sites (cistrome) in the genome of immature gonadotrope cells. To identify ERa pioneer factors and/or co-activators, we determined, by bioinformatic analyses, the enrichment of transcription factor binding sites located in close proximity of ERa motifs. We conducted, in a parallel, the identification of ERa interactome by setting up a state-of-the-art technology based on proximal biotinylation of proteins (BioID) associated with protein quantification by SILAC and MS/MS. This study, still in current investigation in the lab, allowed me to identify ERa protein partners that are bona fide candidates as pioneer factors and co-activators. Results obtained from my PhD work should lead to a better understanding of epigenetic mechanisms regulating the initiation of Nr5a1 expression in gonadotrope cells and, in fine, of gonadotrope cell differentiation. Molecular actors that would be eventually identified may provide potential targets to set up new treatments for idiopathic infertility.

Présentée le 30 mars 2021

Laboratoire où a été préparée la thèse : Unité de biologie fonctionnelle et adaptative, Sorbonne Paris Cité.

Sous la direction de Joëlle Cohen-Tannoudji