Contribution a l’identification des ligands endogènes de deux récepteurs couplés aux protéines G d’intérêt thérapeutique et d’un site de liaison à la mélatonine.
Résumé
Mes travaux de thèse ont porté sur la désorphanisation de deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et sur la caractérisation d’un nouveau site de liaison à la mélatonine (MLT), nommé MTx. Les RCPG représentent la plus grande famille de protéines transmembranaires et sont des cibles privilégiées de traitements pharmaceutiques car ces récepteurs sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Au sein de cette famille, il existe de nombreuxrécepteurs pour lesquels le ligand n’a pas encore été identifié et sont, de ce fait, appelés RCPG orphelins. Nous nous sommes intéressés à deux d’entre eux ayant un intérêt thérapeutique, le GPR88, impliqué dans la schizophrénie et le GPR21, impliqué dans le diabète de type 2. Au cours de cette thèse, nous avons tenté d’identifier les ligands endogènes de ces deux récepteurs.Au cours de notre campagne de désorphanisation du GPR88 nous avons testé l’activité de plusieurs fluides biologiques au cours de tests fonctionnels par mesure de la concentration d’AMPc dans une lignée cellulaire exprimant de façon stable le récepteur et par une technologie ≪ label-free ≫, l’EPIC. Ces expériences nous ont permis de mettre en évidence une activité agoniste spécifique du liquide céphalo-spinal (LCS). Les lots de LCS actifs ont ensuite été fractionnés selon des gradients de poids moléculaire (PM), mettant en évidence une activité agoniste spécifique dans la fraction de plus petite taille, inférieure à 3 kDa. Le fractionnement successif en HPLC phase inverse de cette ≪ fraction < 3 kDa ≫, a mis en évidence de nouvelles fractions actives spécifiques dans les premières eluees, suggérant une molécule plutôt polaire. La dernière fraction active a ensuite été analysée par spectrométrie de masse (MS) à haute résolution afin d’identifier les molécules contenues. La MSnous a permis d’identifier clairement deux entités chimiques, la créatine et l’hypoxanthine, et une troisième pour laquelle nous n’avons pas de formule chimique précise, mais un PM d’environ 175 Da. Une étude approfondie des bases de données des métabolites présents dans le LCS nous a permis d’identifier 10 composés candidats d’environ 175 Da à considérer en plus de la créatine et de l’hypoxanthine. Ces douze composés ont été testés individuellement ou combinés dans le test de mesure d’AMPc sans qu’aucune activité agoniste n’ait pu être identifiée. Ces études nous permettent de conclure que le ligand du récepteur GPR88 est contenu dans le LCS, a un PM inférieur à 3 kDa, est très polaire, ce qui nous permet de rejeter les lipides et les acides gras. Nous pouvons également exclure les petites molécules testées de la liste de ligands potentiels, sans pour autant rejeter leurs énantiomères non commercialement disponibles. D’autres techniques de séparation/fractionnement(par exemple une chromatographie HILIC) et une réduction des délais entre les fractionnements et les tests fonctionnels garantissant une meilleure stabilité de la molécule, nous permettront certainement d’identifier le ligand du GPR88.
Abstract
G-protein coupled receptors (GPCR) are the largest transmembrane protein family of the genome.Although, they are involved in numerous physiological processes, there are still some receptors among this family for which no ligand has been identified yet. These are called orphan receptors. We focused on two of these orphan receptors: GPR88 and GPR21, showing therapeutic potential in schizophrenia and diabetes mellitus, respectively. During this PhD thesis, we aimed to identify the ligands of these receptors using functional assays and by screening endogenous compounds libraries. Our approaches allowed us to identify the cerebro-spinal fluid (CSF) as a source for the GPR88 receptor ligand. This molecule appears to be very polar with a molecular weight below 3kDa . We also ruled out some compounds contained in the CSF, that we identified in active fractions by mass spectrometry. Concerning GPR21, the assays developped in our laboratory did not permit to detect any specific activity in the libraries nor in the tested biological fluids. In a second part of this PhD program, we pharmacologically characterized a new melatonin (MLT) binding site, named MTx. This site was discovered through autoradiography experiments, with high radiolabelled doses of MLT. MLT is a hormone, mainly synthesized at night by the pineal gland. It is involved in numerous physiological processes and in regulating circadian and circannual rhythms. The identification of this new site, as well as deciphering its roles, might allow us to enrich our knowledge on MLT, and to understand the mode of action of some treatments involving melatoninergic compounds. This site has a pharmacological profile unprecedently described. It can bind both MLT and serotonin, which is not the case with classical melatoninergic nor serotoninergic receptors. Our objectives for the work on MTx, was to identify the gene/protein responsible for the MLT binding and subsequently perform functional studies to further characterize this protein.
Présentée le 20 décembre 2019
Laboratoire où a été préparée la thèse : Neuroendocrine EndOcrine and GeRminal DIfferentiation and Communication (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime), Université de Rouen, Normandie.
Sous la direction de Jérôme Leprince et Jean Philippe Stephan
