Le contrôle sérotoninergique de la stéroïdogenèse surrénalienne chez le rat : caractérisation pharmacologique et moléculaire du récepteur 5-HT7, et étude des mécanismes de transduction.

Chez tous les vertébrés étudiés à ce jour, la stéroïdogenèse surrénalienne est soumise à un contrôle multifactoriel qui met en jeu des facteurs humoraux, nerveux et locaux. Il a été montré chez plusieurs espèces que la sérotonine (5-HT) est produite au sein même de la surrénale et qu’elle participe en tant que facteur paracrine à la régulation de la sécrétion des corticostéroïdes. Chez la grenouille et chez l’homme, des études menées in vitro dans notre laboratoire ont montré que l’effet corticotrope de la 5-HT est relayé par des récepteurs 5-HT4 couplés positivement à l’adénylyl cyclase. En revanche, chez le rat, le type de récepteur responsable de l’effet corticotrope de la 5-HT sur les cellules glomérulées restait sujet à controverse. Le but du présent travail était (i) de caractériser le type de récepteur sérotoninergique présent dans la glande surrénale de rat, (ii) d’étudier les voies de transductions impliquées dans l’effet stimulateur de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone, et (iii) de déterminer le rôle de la 5-HT dans le contrôle de la stéroïdogenèse surrénalienne au cours du développement.

Nous avons mis au point une technique de périfusion de fragments de cortex surrénalien de rat pour étudier l’effet de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone. A l’aide d’une série de 25 ligands sérotoninergiques, nous avons déterminé le profil pharmacologique du récepteur impliqué dans l’effet stimulateur de la 5-HT sur la cellule glomérulée. Nos résultats indiquent qu’il existe une bonne corrélation entre les puissances des agonistes et antagonistes testés dans notre modèle et les affinités de ces mêmes ligands pour le récepteur 5-HT7 transfecté dans les cellules COS-7. L’expression des ARNm du récepteur 5-HT7 et la présence de la protéine dans le cortex surrénalien du rat ont été confirmées par les techniques de RT-PCR et Western blot. Ces résultats révèlent pour la première fois l’implication des récepteurs 5-HT7 dans la régulation d’une glande endocrine.

Nous avons ensuite déterminé les voies de signalisation impliquées dans l’effet stimulateur de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone. Dans les cellules glomérulées dispersées, l’activation du récepteur 5-HT7 accroît de façon dose-dépendante la production d’AMPc et provoque une augmentation de la concentration calcique intracellulaire ([Ca2+]i). L’incubation des cellules glomérulées en présence d’un agent chélateur des ions Ca2+ ou l’administration d’un bloqueur des canaux calciques de type T abolit l’effet de la 5-HT sur la mobilisation du calcium, ce qui indique que la 5-HT induit un influx de calcium via des canaux de type T. De fait, des études de patch-clamp nous ont permis de montrer, dans les cellules glomérulées, la présence de courants calciques à bas seuil d’activation possédant les caractéristiques biophysiques et pharmacologiques des courants de type T. La 5-HT augmente de façon réversible ces courants et l’effet stimulateur de la 5-HT est aboli par l’administration de bloqueurs des canaux de type T. Les effets stimulateurs de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone sont significativement atténués par les inhibiteurs de l’adénylyl cyclase (AC) et de la protéine kinase A (PKA) ainsi que par un bloqueur des canaux calciques de type T, suggérant que la voie AC/PKA et un influx calcique sont impliqués dans l’effet corticotrope de la 5-HT. L’application d’un analogue perméant de l’AMPc mime l’effet de la 5-HT sur les courants de type T et la [Ca2+]i. Inversement, l’administration d’un inhibiteur de la PKA diminue la réponse calcique et l’activation des canaux de type T induites par la 5-HT. Ces résultats montrent l’implication de la voie AC/PKA dans l’effet stimulateur de la 5-HT sur les canaux de type T. La préincubation des cellules glomérulées avec la toxine cholérique abolit l’effet de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone. Par ailleurs, la dialyse des cellules glomérulées avec un antagoniste des protéines Go/i/s supprime le courant calcique de type T induit par la 5-HT. Il apparaît donc que, dans la cellule glomérulée du rat, la 5-HT stimule l’AC via une protéine Gas et active les courants calciques de type T par un mécanisme dépendant de la PKA. Le système AC/PKA et l’influx calcique sont tous deux impliqués dans la sécrétion d’aldostérone induite par la 5-HT.

Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié l’effet de la 5-HT sur la sécrétion des stéroïdes surrénaliens chez le rat au cours du développement depuis le dernier jour de gestation (E21) jusqu’à l’âge adulte (P90). Nous avons mesuré les taux de sécrétion des corticostéroïdes aux différents stades du développement au moyen de la technique de périfusion. Nous avons observé un pic de sécrétions spontanées de corticostérone et d’aldostérone juste après la naissance (P1) suivi d’un effondrement du taux de production de corticostérone sans modification du taux d’aldostérone au cours de la période P2 à P14. A tous les stades de développement, de même que chez l’adulte, la 5-HT est dépourvue d’effet sur la sécrétion de corticostérone. En revanche, la 5-HT stimule de façon dose-dépendante la sécrétion d’aldostérone dès le 21ème jour de gestation. L’efficacité maximale et la puissance de la 5-HT augmentent jusqu’à P4 puis diminuent progressivement jusqu’à P90. A l’aide d’une série de 8 ligands, nous avons déterminé le profil pharmacologique du récepteur impliqué dans l’effet corticotrope de la 5-HT à P4. Nos résultats indiquent que, chez le raton comme chez l’adulte, la sécrétion d’aldostérone induite par la 5-HT est due à l’activation d’un récepteur 5-HT7. L’expression des ARNm du récepteur 5-HT7 dans la glande surrénale de rat a été mise en évidence par RT-PCR à tous les stades étudiés. Ainsi, la 5-HT pourrait contrôler l’activité sécrétrice des cellules glomérulées dès le dernier jour de gestation et pendant toute la vie du rat via l’activation de récepteurs 5-HT7. L’ensemble de ce travail montre que, chez le rat, la 5-HT libérée au sein de la surrénale, stimule la sécrétion d’aldostérone par l’intermédiaire de récepteurs 5-HT7 couplés à une protéine Gas. L’activation des récepteurs 5-HT7 stimule la voie AC/PKA laquelle va par la suite induire un influx calcique via des canaux de type T. Le système AC/PKA et l’influx de calcium sont tous deux impliqués dans l’effet stimulateur de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone. Nous avons aussi montré que la sécrétion d’aldostérone est sous le contrôle de la 5-HT dès le 21ème jour de gestation et que l’efficacité et la puissance de la 5-HT varient considérablement au cours du développement de la glande surrénale de rat.

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Summary :

In all vertebrates studied to date, adrenal steroidogenesis is under the control of multiple factors including humoral, neuronal and local agents. It has been shown that, in several species, serotonin (5-HT) is produced within the adrenal gland itself and regulates the secretion of corticosteroids through a paracrine mode of communication. In frogs and humans, in vitro studies performed in our laboratory have shown that the corticotropic effect of 5-HT is mediated through activation of 5-HT4 receptors positively coupled to adenylyl cyclase. In contrast, in rat, controversial data have been reported concerning the type of receptor mediating the corticotropic effect of 5-HT on glomerulosa cells. The aim of the present study was (i) to characterize the type of serotonergic receptor present in the rat adrenal gland, (ii) to investigate the mechanism of action associated with the activation of the 5-HT receptor responsible for the control of aldosterone secretion, and (iii) to determine the role of 5-HT in the control of adrenal steroidogenesis during development.

We have set up a perifusion technique for rat adrenocortical fragments to study the effect of 5-HT on aldosterone secretion. By using a series of 25 serotonergic ligands, we have characterized the pharmacological profile of the receptor responsible for the stimulatory effect of 5-HT on glomerulosa cells. Our results demonstrate that there is a good correlation between the potencies of the agonists and antagonists tested in our model and those previously reported for the 5-HT7 receptor transiently expressed in COS-7 cells. The expression of 5-HT7 receptor mRNA and the occurrence of the protein in the rat adrenal cortex have been confirmed by RT-PCR and Western blot analysis. These data provide the first evidence for the implication of 5-HT7 receptors in the control of an endocrine gland.

We have then investigated the signal transduction mechanisms involved in the stimulatory effect of 5-HT on aldosterone secretion. In dispersed rat glomerulosa cells, the activation of 5-HT7 receptors stimulated cAMP production in a dose-dependent manner and induced an increase in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i). Incubation of glomerulosa cells with a Ca2+ chelator or administration of a T-type calcium channel blocker abolished the effect of 5-HT on [Ca2+]i, indicating that 5-HT induces calcium influx through T-type calcium channels. Indeed, patch-clamp studies on glomerulosa cells have revealed the presence of low-voltage-activated calcium currents which exhibit the typical biophysical and pharmacological properties of T-type current. We found that 5-HT reversibly enhanced the amplitude of the T-type current and that the stimulatory effect of 5-HT was abrogated by the administration of T-type calcium channel blockers. 5-HT-induced aldosterone secretion was significantly reduced by adenylyl cylase (AC) and protein kinase A (PKA) inhibitors as well as by a T-type calcium channel blocker, suggesting that both the AC/PKA pathway and the calcium influx are involved in the corticotropic effect of 5-HT. Application of a permeable analogue of cAMP mimicks the effect of 5-HT on T-type currents and [Ca2+]i. Reciprocally, the stimulatory effects of 5-HT on the T-type current and [Ca2+]i were both attenuated by a protein kinase A inhibitor. These data demonstrate the implication of the AC/PKA pathway in the stimulatory effect of 5-HT on T-type calcium channels. Pretreatment of glomerulosa cells with cholera toxin abolished 5-HT-evoked aldosterone secretion. Similarly, dialysis of glomerulosa cells with a Go/i/s protein blocker abrogated the 5-HT-induced T-type calcium current. It thus appears that, in the rat glomerulosa cell, 5-HT stimulates AC through a Gas protein and activates T-type calcium currents via a PKA-dependent process. Both the AC/PKA system and calcium influx are involved in 5-HT-induced aldosterone secretion.

In the last part of this work, we have investigated the effect of 5-HT on adrenal steroid secretion in rat during development, from the last gestional day (E21) to the adult stage (P90). The rate of corticosteroid secretion has been studied at different times of development by means of the perifusion technique. We have observed a peak of spontaneous corticosterone and aldosterone secretions just after birth (P1) followed a marked decline of corticosterone production without substantial modification of aldosterone from P2 to P14. At all developmental stages, as in adult, 5-HT had no effect on corticosterone secretion. In contrast, 5-HT stimulated aldosterone secretion in a dose-dependent manner as early as E21. The maximal efficacy and potency of 5-HT peaked at P4 and gradually declined until P90. By using a series of 8 ligands, we have determined the pharmacological profile of the receptor involved in the coticotropic effect of 5-HT at P4. The results indicate that, in newborn rat as in adult, 5-HT7 receptors mediate the effect of 5-HT on glomerulosa cells. The expression of 5-HT7 receptor mRNA in the rat adrenal gland has been evidenced by RT-PCR at all stages studied. Thus, in rat, 5-HT may control the secretory activity of glomerulosa cells through the activation of 5-HT7 receptors from the last gestional day to adulthood.

In conclusion, these data have shown that 5-HT released in the adrenal gland regulates aldosterone secretion through 5-HT7 receptors coupled to a Gas protein. The activation of 5-HT7 receptors stimulates the AC/PKA pathway, which in turn induces calcium influx through T-type calcium channels. Both the AC/PKA system and calcium influx are involved in the stimulatory effect of 5-HT on aldosterone secretion. We have also shown that 5-HT triggers aldosterone secretion from the last gestional day to adulthood and that the efficacy and potency of 5-HT undergo marked variations during the development of the rat adrenal gland.